灵芝多糖诱导人肝癌细胞HepG2凋亡

徐晋，吴丽，徐巧芳

(江苏省第二中医院外科，江苏南京 210017)

 

    肝必复软胶囊的主要成分取自树舌灵芝多糖，能有效促使乙肝表面抗原转阴，为乙肝患者带来康复福音。本文就药理学角度，初步研究探讨灵芝多糖诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的作用。

    20世纪70年代以来，国内外一系列研究证明传统中药灵芝(Ganoderma lucidum)具有免疫调节、抗病毒、保肝、抗氧化等药理作用，尤其是其抗肿瘤活性日益受到关注。灵芝多糖(GLPS)是灵芝水提物中的主要活性成分，对动物移植性肿瘤具有抑制作用，可使瘤重减轻，生存时间延长。但其作用机制目前还处于研究阶段，因此本研究主要通过观察灵芝多糖与常规化疗药物 (氟尿嘧啶) 联合使用对人肝癌细胞HepG2的体外生长状况，检测 Caspase-3、Caspase-8酶活性有无显著变化，并采用Western-blotting技术检测作用后肝癌细胞HepG2的细胞色素C、Caspase-3、Caspase-8蛋白的表达水平，对其抗肿瘤机制做进一步的研究，为灵芝多糖的药用价值提供新的实验依据。

    1 资料与方法
    1.1 实验资料
    段木栽培灵芝多糖 (Ganodenna lucidum Polysaccharides，GLPS)由福州绿谷生物药业技术研究所提供。褐色粉末，易溶于水，平均分子量为584900。多糖与肽的比值为93.45％：6.49％，多糖部分由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖组成；MTT[溴化 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑](美国sigma公司产品)、二甲基亚砜(DMSO，上海凌峰公司,分析纯)、RPMI 1640培养液(DMEM)和胎牛血清(美国GIBCO公司)、氟尿嘧啶注射液(南通精华制药有限公司，批号080212)、兔抗人细胞色素C、Caspase-3、Caspase-8、一抗IgG(美国Santa Cruze公司) 、B-actin单抗、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗IgG(武汉博士德生物有限公司)，其余试剂均为分析纯级。

    1.2 细胞处理
    肝癌HepG2细胞，购丁上海亚培生物科技有限公司，细胞用5％胎牛血清的RPMI 1640培养液，37℃，5％C02，传代培养。每24～48小时传代1次。控制细胞密度为 2×105／ml，加药时稀释培养液，加入无血清R PMI 1640配制成的各组含药培养液200μL，37℃，5％CO共孵育48h后，监测各项指标。

    1.3 分组方法
    分为A、B、C、D、E 5组，其中，A组：对照组；B组：氟尿嘧啶50μg/ml；C组：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS 1μg/ml；D组：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS 10 μg/ml；E组：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS μg/ml。

    1.4 MTT法测细胞增殖抑制率
    MTT粉剂以超纯水配制成5 mg/ml工作液，细胞作用48h后，每孔加入20μL MTT，37℃孵育4h，吸出孔内培养液后，加入DMSO 100 μL终止反应，继续孵育30min，待结晶完全溶解后，490nm波长下用全自动酶标仪测定各孔OD值。细胞增殖抑制率计算公式：抑制率(％)=(实验组OD值/对照组0D值)×100％。
 
    1.5 流式Annexin V／PI法检测细胞凋亡
    细胞作用后，以1：4稀释Binding buffer(50ml Buffer+150 ml蒸馏水)重悬细胞，并坷整细胞浓度lx106 ／m1．取95μl细胞悬液加入1μL Annexin V-FITC，室温孵育30min加入2μLPI，室温孵育10min，上流式细胞仪检测。

    1.6 Caspase活性检测
    Caspase-3、Caspase-8活性测定是依据色敏底物DEVD-pNA(对硝基苯胺)被活化的Caspase-3剪切后产生的 pNA单体，在400 nm波长的光密度(A)值而测定。细胞作用48h后，按照试剂盒说明书操作，测定A值。以 A400值表示Caspase-3、Caspase-8活性大小。

    1.7 Western-Blotting方法检测HepG2细胞的Caspase-3、Caspase-8蛋白的表达水平
    将细胞培养于10 cm的培养皿中，药物作用 48h后，用细胞刮刀将细胞刮下，加入100L细胞裂解液冰上裂解30min。所得裂解液于4℃下12000 r／min离心机离心10min。取清液加入1／4体积的5xSDS蛋白加样缓冲液．煮沸10 min。所得蛋白样品经12％SDS-PAGE分离后，电转至硝酸纤维素膜上，以5％的脱脂奶粉37℃封闭2h后，依次加入一抗(室温2h，PBS／T洗2次)、羊抗兔二抗(室温2h，PBS／T洗2次)，ECL暗室中显色。运用Bioimagining System成像分析系统观察Westem-B1otting结果，对反应条带灰度扫描并进行半定量分析。

    1.8 统计学处理
    采用 SPSS11.0软件处理系统进行统计学分析。实验数据以x+s表示。统计学方法采用F检验、Pearson相关分析，组内比较采用配对样本t检验，组间计量资料均数比较用方差分析，P<0.05．差异有统计学意义。

    2 结果
    2.1 GLPS对肝癌细胞HepG2增殖的影响
    GLPS对肝癌细胞HepG2增殖的影响见表1 。MTT结果显示：单独使用氟尿嘧啶对HepG2细胞的增值抑制较低，GLPS 1μg/ml、10 μg/ml、100μg/ml 3个剂量与氟尿嘧啶 50μg/ml联合使用对HepG2细胞增殖较单独使用氟尿嘧啶的B组细胞均有显著抑制作用(P<0.05)，抑制作用随药物浓度增高而有加强趋势，最高抑制率可达34.8％，且3个剂量组间比较，P<0.05，差异有统计学意义。

 

 

 

    2.2 GLPS作用后肝癌细胞HepG2的细胞凋亡
    流式细胞仪 Annexin V／PI法检测肝癌细胞HepG2在药物作用48h后的凋亡百分率。结果显示单独使用氟尿嘧啶的B组细胞未发生明显的凋亡(P>0.05)，而联合使用GLPS的处理组细胞，凋亡的细胞明显增加，见图1，且随着GLPS使用浓度的增大，凋亡细胞的比例也有所上升(P<0.05)。

    2.3 HepG2细胞的Caspase活性
    细胞作用48h后测定对照组及各处理组Caspase-3、Caspase-8酶活件的A400值，图2。结果显示，与对照组比较，单独使用氟尿嘧啶的B组细胞Caspase酶活性无统计学意义(P＞0.05)，而联合使用GLPS的处理组细胞Caspase-3、Caspase-8 酶活性显著升高(P<0.05)，且GLPS低浓度使用时Caspase-8酶活性显著升高，随着GLPS使用浓度的增加，Caspase-3酶活性逐渐增强。

 

 

 

    2.4 HepG2细胞的Caspase-3、Caspase-8、线粒体细胞色素C蛋白的表达
    与对照组比较，单独使用氟尿嘧啶的B组细胞Caspase-3、Caspase-8、线粒体细胞色素C蛋白的表达，P>0.05，差异无统计学意义，如图3；而联合使用GLPS处理的各组细胞的蛋白则有显著变化，GLPS低浓度使用时线粒体细胞色素C、Caspase-8蛋白表达显著升高。随着GLPS使用浓度的增加，Caspase-3蛋白表达也逐渐增强，与β-actin相比的相对表达量见图4。 

 

 

 

    3 讨论
    灵芝多糖是从灵芝中提取的一种新内源活性物质，其所含的化学成分能够显著提高吞噬细胞的吞噬能力，增强体液免疫和细胞免疫功能，还能提高红细胞中超氧化物歧化酶SOD活性，对人体具有显著的抗肿瘤、抗癌作用。灵芝多糖抗肿瘤活性能是通过其对免疫活动或对宿主功能的影响而介导的，且水溶性多糖能起着更重要的作用。HepG2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征，是研究和评价防治肝癌药物的较理想的细胞模型。

    本实验采用MTT法测定细胞活性，并计算细胞增值抑制率。研究结果表明，GLPS 1、10、100μg/ml 3个有效药物浓度与常规化疗药物氟尿嘧啶50 μg/ml联合使用对HepG2细胞增殖有显著抑制作用，其最大抑制率可达34.8％，提示GLPS能在一定程度上抑制人肝癌细胞的增殖以延缓肝癌的进程。

    细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种特殊的细胞死亡形式。细胞凋亡信号能引起线粒体细胞色素C释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素C能与Apaf-1、Caspase-9前体、ATP／dATP 形成凋亡小体 (apoptosome)，进而引发Caspase级联反应。

    凋亡程序的启动及执行过程中，Caspase-3是Caspase级联反应中最关键的效应蛋白酶，通常以酶原的形式存在，激活后通过酶解其特异性底物，使细胞发生凋亡。本次实验发现，GLPS与氟尿嘧啶联合作用48h后，肝癌HepG2细胞中Caspase-3、Caspase-8酶活性明显升高，Western-Blotting实验证实，低浓度GLPS与氟尿嘧啶联合作用组，Caspase-8、细胞色素C蛋白表达显著升高，而随着GLPS浓度升高，Caspase-3蛋白表达量亦逐渐升高，而单独使用氟尿嘧啶时与对照组比较，差异无统计学意义。由此笔者认为GLPS与氟尿嘧啶联合作用可能会诱导HepG2细胞释放细胞色素C，引起Caspase的级联反应，从而进步导致HepG2细胞的凋亡。本实验通过Annexin V／PI流式细胞仪检测，证实GLPS与氟尿嘧啶联合作用后，HepG2细胞发生了显著的凋亡。

    由此，我们推断灵芝多糖可能与化疗药物存在一定的协同作用，联合使用有较好的抗肿瘤效应，可能成为有效的肿瘤化疗辅助药物，有重要的研究意义，具有一定的运用前景。

 

(收稿日期：2009-10-13)